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大豆研究所 教育部大豆生物学重点实验室 |
从大豆疫霉菌 ESTs 中发掘 SSR 标记
朱振东① 霍云龙①② 王晓鸣①＊ 黄俊斌② 武小菲①
(①中国农业科学院作物品种资源研究所, 北京 100081; ②华中农业大学植物保护系, 武汉 430070.
* 联系人, E-mail: wangxm@mail.caas.net.cn)
摘要 通过对 5800 条大豆疫霉菌 EST 进行电子查询, 在 369 条 EST 中发现 415 个 SSR. 在筛选的EST序列中SSR平均密度为每 8.9 kb含有1个SSR. 在鉴定的SSR中, 三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的 50.1%, 四核苷酸重复基元的 SSR 类型最少, 为 8.2%. 设计 40 个 SSR 引物对对 5 个大豆疫霉菌菌株基因组DNA进行PCR扩增, 有33个引物对扩增出SSR特征条带, 其中有28个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的条带. 在 33 个功能性引物对中, 有 15 个引物对在 5 个大豆疫霉菌菌株间扩增出多态性, 多态性引物对占 45.5%. 基于 SSR 标记进行聚类分析, 可将 5 个检测大豆疫霉菌菌株划分为不同的3个组. 本研究建立了大豆疫霉菌的SSR标记, 为大豆疫霉菌及相关属种的鉴定、遗传变异、分子作图等研究提供了一种更加有效的分子标记系统.
关键词 表达序列标签 SSR 标记 大豆疫霉菌 大豆
由大豆疫霉菌((Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫霉根腐病是严重影响大豆生产的毁灭性病害之一[1,21.防治该病惟一经济、有效和环境安全的方法是利用抗病品种.然而，由于大豆疫霉菌具有高度的变异性和种植抗病品种造成的选择压力，大豆疫霉菌种群变异很快，毒力结构十分复杂[[3-5].大豆疫霉菌致病变异性一般是通过接种一套含有不同抗病基因(Rp、基因)的大豆鉴别品种进行毒力检测来评价.用致病性作为病原菌遗传变异的标记存在一些缺点，如费工费时、需要很大的温室空间、受温湿度及接种技术的影响导致结果不稳定等，而且抗病性和感病性的分类有时存在主观性.因此，需要利用更加有效的遗传标记来研究大豆疫霉菌的遗传变异.
分子标记技术已成为植物病原真菌遗传变异研究和检测的重要手段.一些基于DNA的分子标记，如rDNA-ITS, RFLP, RAPD等技术也已应用于大豆疫霉菌的鉴定、遗传变异及多样性、无毒基因作图等研究[6-10].然而，与RFLP及RAPD等分子标记相比，更加有效的SSR标记虽然在一些植物和动物中已被广泛开发和应用，但在真菌中却开发得很少[“一‘41.简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)或微卫星(micro satellites)是以1-6个碱基为基元的串联重复序列，它们普遍存在和随机分布于大多数真核生物的基因组中，重复数具有高频率的变异，这种专化位点的多态性可以十分容易地通过设计特异引物进行PCR扩增检测.SSR标记具有多态性高、多等位性、共显性、容易用PCR检测、重复性高等特点，是一种理想的分子标记，但从基因组文库中开发SSR标记是昂贵和低效的.随着表达序列标签(expressed sequence tag, EST)技术的发展，EST数据库为开发SSR标记提供了快速、有效和廉价途径.一些植物如葡萄、小麦的EST-SSR标记已开发利用[[I’一‘81.在植物病原真菌中，Kaye等人[[ii]也开发了少量水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的EST-SSR标记.由于疫霉菌是世界上最具破坏力的一类植物病原菌，为了更加深入的从分子水平研究疫霉菌的致病性，国外已经开始了疫霉菌基因组计划((Phytoph-thora Genome Initiative)"".大豆疫霉菌作为经济重要的病原菌成为疫霉菌基因组研究的主要对象，表达序列研究已经开展[[2o1.迄今，在GenBank中已有近30000条大豆疫霉菌EST，但大豆疫霉菌SSR的研究尚未开展.本研究将从大豆疫霉菌EST中发掘SSR标记，为大豆疫霉菌及相关属种的鉴定、遗传变异、分子作图和系统进化等研究提供一种更加有效的分子标记系统.
1材料与方法
(i)大豆疫霉菌EST序列数据来源.
大豆疫霉菌EST序列来自于植物病原真菌和卵菌EST数据库(Phytopathogenic Fungi and Oomycete EST DatabaseVersion 1.4)(http://cogeme.ex.ac.uk/)，共5849个单一的单个EST序列或由EST拼接的Contig序列.
(ii)从EST中发掘SSR.
EST序列下载后去除49条属于大豆和细菌污染序列及低质量序列，用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple
Sequence Repeat Identification Tool)对5800条序列进行SSR鉴定(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool).含二、三、四、五和六核普酸基元精确SSR的最小重复数分别为8, 5, 4, 3和3次.
(iii) PCR引物设计和PCR扩增.
38个含有三核普酸基元SSR的EST, 1个含有SSR(TA)3s的EST和1个含SSR(GA)31的EST被选择进行引物设计.用DNAstar软件包中的Editseq和Primerselect软件设计SSR引物.引物设计的主要参数为:引物长度为17-24 bp; PCR产物大小为90-350 by;引物退火温度为45'C -60'C，上下引物之间退火温度相差不超过2℃;(G+C)含量为40%-70%，最适为50%.引物对由北京赛百盛基因技术有限公司合成.大豆疫霉菌菌株PS96-41一1, B77R1.55, PS96-40-2, PS96-16-1和PSJ99-15用于合成引物的PCR检测，基因组DNA来源于本实验室.试验菌株的详细信息见表1. PCR扩增参照Scott等人[is]的方法.PCR产物用6%尿素变性和银染聚丙烯酞胺胶分析.
2结果与分析
2.1大豆疫霉菌EST-SSRs的特征
对总长约3700 kb的5800条EST进行筛选，共在369条EST中发现415个SSR，该结果表明有6.4%的EST含有SSR，大豆疫霉菌基因组表达部分平均每8.9 kb含有1个SSR.在369条含有SSR的EST中，每条EST中只含有1个SSR的为328条，每条EST含有2个SSR的为37条，有3条EST含有3个SSR，有1条EST含有4个SSR.在鉴定的SSR中三核普酸重复基元的SSR类型最多，占鉴定总数的50.1%，之后，依次为六核普酸((16.6%)，二核普酸(12.8%)，五核普酸(12.3%)和四核普酸(82%)(表2).共有185个SSR基元被发现，其中GA基元是出现频率最高的EST-SSR类型(图1).表2在5800个大豆疫霉菌EST中发掘的不同基元SSR．
2.2 SSR标记发展及多态性检测
设计40个SSR引物对，在给定的条件下对大豆疫霉菌基因组DNA进行PCR扩增，除7对引物未产生扩增产物外，其余33对引物(82.5%)均扩增出SSR特征条带.表3为33个具有功能性引物对的相关信息，图2为部分引物对在大豆疫霉菌菌株中的扩增模式.在33个功能性引物对中，有4个引物对((12.1%)扩增出1条产物带，其中有3个引物对的扩增产物在预期片段大小范围之内，1个引物对的扩增产物小于预期片段大小;有29个引物对(87.9%)扩增出2条或2条以上条带，其中有25个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的的条带.共有28个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的的条带，占功能性引物对的84.8%.此外，在29个扩增出2条或2条以上条带的引物对中，有9个引物对扩增出比预期片段大的条带，有26个引物对扩增出比预期片段小的条带.在33个功能性引物对中，有15个引物对在5个大豆疫霉菌菌株PS96-41-1, B77R1.55, PS96-40-2,PS96-16-1和PSJ99-15间扩增出多态性，多态性引物对占45.5%. 15个引物对在5个分离物中共扩增出20个多态性标记.基于这20个SSR标记进行聚类分析，可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为不同的3个组(图3).在4个检测的中国菌株中，PS96-41-1, PS96-40-2和PS 96-16-1分离于1996年，PSJ99-15分离于1999年;PS96-41-1, PS96-40-2和PSJ99-15分离于黑龙江佳木斯市，其中PS96-41-1和PS96-40-2分离于相邻田块的相同大豆品种，PS96-16-1分离于黑龙江穆林.通过SSR聚类，将PS96-41-1和PS96-40-2归在1组，将PS96-16-1和PSJ99-15归为一组，表现出大豆疫霉菌遗传多样性在地理和时空上的差异.菌株B77R1.55来源于美国，与PS96-16-1聚类在一组，表明这2个大豆疫霉菌菌株遗传关系较近.
3讨论
对5800条大豆疫霉菌EST进行筛选，共在369条((6.4%)EST中发现SSR位点，筛选的大豆疫霉菌EST序列平均每8.9kb含有1个SSR.以相同标准对来自同一数据库的1414条致病疫霉菌((Phytophthor-ainfestans)的EST进行SSR鉴定，结果表明，只有1.8%的EST含有SSR，筛EST的SSR平均强度约为每30 kb含有1个SSR.比较而言，大豆疫霉菌含有SSR的EST频率很高，SSR十分丰富.大豆疫霉菌基因组大小约为62 Mb[2'1，而致病疫霉菌基因组大小估计为250 Mb 122', 2种疫霉菌基因组SSR出现的频率似乎与其基因组的大小负相关.这一假设与Morgante等人[[23]对植物基因组中SSR出现的频率研究结果相一致.Morgante等研究表明某一植物基因组中SSR出现的频率与该植物基因组大小和重复DNA序列所占的比例负相关，与基因中转录部分的比例及低拷贝序列出现的频率显著正相关. 在鉴定的大豆疫霉菌EST-SSR中以三核普酸重复基元最丰富，占鉴定总数的50.1%，同样，在致病疫霉菌EST-SSR中三核普酸重复基元也最多，占鉴定总数的39.3%.本研究的结果与以前报道的在一些植物中的研究结果一致[17,24,251.在基因编码区主要存在三核普酸重复类型可能是三核普酸重复数的变异不会引起移码突变，从而减少突变的压力.Gao等人[[17]发现许多三核普酸与具有重要功能的基因相关，如CCG重复涉及许多基因的功能，如胁迫抗性、转录调控、信号传导等.SSR被认为是位点专化性的，因此，一个引物对一般只期望扩增一条带或共迁移的双带.然而，在本研究中，33个功能性EST-SSR引物对中有29个扩增出2条或2条以上条带.这种现象在其他研究中也有报道.在六倍体小麦中，单个EST-SSR引物对扩增多SSR位点被认为是由于多个部分同源位点的扩增[‘“].在一些牧草内寄生菌(Neotyphodium spp)中，这种现象归结于一个假设的杂交起源而形成的异倍体[[261而异型杂交可以导致一些二倍体首稽基因型的多个EST-SSR等位点[‘“].大豆疫霉菌为二倍体，具有高度的异质性和无性突变的能力，虽然为同宗配合，但也能通过异型杂交而产生新的致病类型[[5,91.因此，大豆疫霉菌的异质体、无性突变体或杂合体的存在可能是EST-SSR引物对扩增多个产物的原因.另外，基因扩增也可能导致扩增多EST-SSR位点.Mao和Tyler [271通过对大豆疫霉菌基因组中的串联重复序列进行研究，认为基因扩增导致大豆疫霉菌遗传多样性的产生.EST-SSR标记在大豆疫霉菌种内能够检测到较高水平的多态性.在33个功能性EST-SSR引物对中，有巧个引物对在5个大豆疫霉菌菌株间扩增出多态性，共扩增出20个多态性标记.王化波等人[[81利用从200个RAPD引物中筛选出的13个多态性引物对75个中国大豆疫霉菌菌株和11个美国菌株进行遗传多样性分析，将86个菌株聚类为4个RAPD遗传组.本研究所用的5个检测大豆疫霉菌菌株分属于4个不同的RAPD组(图4).基于20个EST-SSR标记，我们将这5个菌株分成3个组(图3)，与王化波等的结果具有一定差异.导致这种差异存在的可能原因是王化波等所用的13个RAPD引物是从200个引物中筛选出的具有高多态性引物，在5个菌株中共检测出50个多态性标记，而本研究所用EST-SSR引物对相对较少.一些研究已经表明，不同的分子标记系统可能检测到的多样性水平不同，在某些情况下获得的结果甚至相互冲突[[7,9,281.相对而言，RAPD分析虽然能够检测出较高的多态性，但RAPD多态性与大豆疫霉菌地理分布及毒力不具有相关性[[81.在本研究中，EST-SSR标记能够将4个中国大豆疫霉菌菌株从地理上和时空上区分.当然，这一结果的正确性还需要通过开发更多的SSR引物并对大量菌株进行研究来加以验证.
虽然SSR标记具有许多优点，但植物病原菌真菌中开发得很少，而在卵菌中还没有研究.随着植物病原菌基因组研究的发展，多种不同类型植物病原菌的EST已被开发.从EST数据库中发掘SSR标记，为植物病原菌SSR标记的发展提供了一种便利的途径.本研究从大豆疫霉菌EST中发掘SSR标记，证明了这种途径的有效性和高效性.虽然EST-SSR标记与其他一些从非编码区分离的标记相比在种内检测的多态性水平要低，但他们检测的是基因组表达部分的变异，因此将为功能基因提供“绝对的”标记，这将可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定.EST-SSR标记来自于基因转录编码区，具有鉴定大豆疫霉菌无毒基因的极大潜能，为利用分子标记鉴定生理小种提供了可能性.另外，EST-SSR标记具有很高的通用性，一旦开发，可以在许多相关种(属)中应用.因此，大豆疫霉菌EST-SSR标记的开发利用，为大豆疫霉菌及相关属种的起源、系统进化及相互间遗传关系的研究提供了一种理想工具.
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