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　　转基因作物的环境安全性问题一直是社会关注的热点.转基因作物环境安全管理的核心是防止外源基因漂移到野生种或者近缘野生种中.墨西哥是重要的玉米起源地，转基因玉米的种植使墨西哥本土玉米受到转基因污染的事件在国际上引起了极大的关注[‘一3].2004年8月，中国食品产业网转载路透社报道，从巴西14个州抽出的7374份大豆样品中有296份转基因检测为阳性[[4]，其中117份阳性样品生产商未申明他们的产品为转基因大豆.近年来，我国大豆需求日益增加，2002/2003年度大豆进口量达1842万吨，2003/2004年度达到1650万吨.进口大豆主要来自美国、阿根廷和巴西等国，转基因大豆占64.49%[5,6].但到目前为止，转基因大豆还未获准在我国进行种植生产.中国是大豆原产国，栽培品种(类型)和野生(型)资源极为丰富，在转基因大豆大量进口的情况下，我国本土的非转基因大豆生产安全应引起我们的高度重视.因此，调查分析我国的大豆生产是否受到进口转基因大豆的影响，对我国大豆生产与国际贸易具有非常重要的意义[[7,a].本研究采集了我国大豆主产区(黑龙江省)的田间大豆样品，并进行了转基因成分的检测分析.

1材料与方法

(i)材料.

　　待检样品采自黑龙江省哈尔滨、黑河、佳木斯、双鸭山、鸡西地区的24个县，涉及124个屯、乡的大豆生产田，采集样品地点为210个，共采集样品1050份，制备有效检测样品210份.阳性样品为进口美国转基因大豆(roundup ready, RR)，由国家动植物检疫局馈赠;阴性样品为大豆品种合丰39,由黑龙江省合江农科所馈赠.

(ii)取样方法.

　　2003年9月下旬(大豆采收前)，在黑龙江省哈尔滨、黑河、佳木斯、双鸭山、鸡西地区按照种子扦样原则，以每个地区为中心沿国道辐射性的在沿途大豆生产田采样，每5-10 km取一个田块.每个田块依照对角线选取5个采样点，每个点随机采30个豆荚.将同一田块5个点所采样品混合，作为一份样品.样品剥去豆荚，将豆粒混匀，按照四分法原则，随机选其中一份，作为待检样品.其余种子作为备查样品保存.

(iii)大豆种子DNA提取.

　　将待检样品放入飞利浦HR-1707搅拌机中打磨2 min，取100 mg粉碎好的样品到2 mL的离心管中，加入60℃预热的CTAB提取液1 mL, 8-10 VtL蛋白酶K(20 mg/mL),混匀后于60'C水浴30 min，期间混匀3次.12000 r/min室温离心6 min，取上清分别用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(等体积比)各抽提1次，12000r/min室温离心6 min.将水相转移到另一离心管中，加入1/10体积的NaAc(3 mol/L)混匀，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置1 min，于40C, 13000r/min离心10 min.弃去水相，用冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，并于4'C, 13000 r/min离心5 min.用枪头小心吸去乙醇，在室温风干DNA后溶于50 VtL无菌水或TE缓冲液中，加入1 VtL RNase于37℃温育30min. -20'C保存[9]．

( iv ) PCR定性检测.所有引物设计参照

　　GeneBank序列及黄昆仑等人[1o]的报道，所用引物序列为:Lectin-1, 5'-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'; Lectin-2, 5'GCCCATCTACAAGCCTTTTTGTG-3';35S一1, 5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTG-3'; 35S-2,5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCAT-3'; Nos-1, 5'-GA-ATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'; Nos-2, 5'-TTATCCTA-GTTTGCGCGCTA-3'; CP4-EPSPS一1，5'-CCTTCATG-TTCGGCGGTCTCG-3'; CP4-EPSPS-2, 5'-GCGTCAT-GATCGGCTCGATG-3'. Lectin-1和Lectin-2预期扩增产物118 bp; 35S-1和35S-2预期扩增片段长195 bp;Nos-1和Nos-2预期扩增片段长180 bp; CP4-EPSPS-1和CP4-EPSPS-2预期扩增片段长为498 bp. PCR反应体系为:lOX PCR反应缓冲液(含Mg++), 200 mmol/LdNTPs, 0.25 Vtmol/L引物，2.5 U枢L Taq DNA聚合酶，1 VtL DNA模板，用灭菌重蒸水补齐至20 VtL.反应程序为:94℃预变性8 min; 94℃变性40 s，适宜温度(Lectin, CaMV35S启动子，Nos终止子和CP4-EPSPS引物扩增时的退火温度分别为590C, 590C,560C,62'C)退火50 s, 720C延伸1 min, 35个循环;72'C延伸7 min.最后于4℃保存[X11'. PCR产物凝胶回收采用天为公司离心柱型琼酷糖凝胶DNA回收试剂盒.回收DNA片段分别用不同的限制性核酸内切酶处理，将产生特异的酶切片段(表1).

(v)巢式PCR检测.

　　1轮扩增引物序列为N35S/CTP4一1(5'-TGTGCTGTAGCCACTGATGC-3')和N3 5 S/CTP4-2 (5'-TGATGTGATATCTCCACTGACG-3'),预期扩增片段长348 by.第2轮扩增引物序列为N35S/CTP4-3(5'-TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT-3')和N35 S/CTP4-4(5'-CTGACGGTAAGGGATGACGC-3')，预期扩增片段长147 bp. PCR反应体系第1轮同前，第2轮因模板不同，以第1轮扩增产物为模板(1VtL)，其余与前相同.退火温度为600C.

(vi)扩增产物的克隆和序列分析.对PCR检测结果中出现的可疑阳性片段，用试剂盒回收并连接到pGEM-T easy载体中，送三博公司进行测序.测序结果在NCBI数据库中进行同源性分析.

2结果与分析

2.1 DNA提取及内标基因检测
　　使用粉碎机磨碎大豆籽粒或液氮研磨大豆真叶和根作为起始材料，采用改良CTAB法提取大豆DNA.提取的DNA在电泳检测中呈清晰、一致的条带(结果未显示).大豆凝集素Lectin存在于所有品种的大豆中，因此通常被用作内标基因，用该基因的PCR检测来确证DNA的模板质量.对210份样品都做了Lectin基因扩增，图1显示部分样品检测结果，除空白对照呈阴性外，阳性对照与待检样品都扩增出与预期大小一致的特异性条带(118 bp).结果显示所提取DNA模板符合进一步PCR扩增检测的要求.

2.2 210份大豆样品中外源基因的检测及酶切鉴定

(i)CaMV35S启动子.

　　除阳性对照外，所有样品在该引物的扩增中没有出现特异性条带(结果未显示).

(ii)大豆草甘嶙抗性基因CP4-EPSPS.

　　有13个样品在该引物的扩增中呈现阳性，但扩增片段比阳性对照样品的扩增片段略大(图2).进一步回收扩增片段，用BamH工酶切.阳性对照样品的扩增片段酶切得到预期大小的DNA片段(391和107 bp)，而检测样品的扩增片段不能被BamH工酶切(图3).以上结果说明，这13个样品的扩增产物不是CP4-EPSPS基因，可初步确定为假阳性.

(iii) NOS终止子.

　　在该引物扩增中只有1个样品(编号:0x1)出现特异条带(图4)，对其PCR产物回收后进行酶切分析结果和预期结果一致，可切出118和72 by的片段(图5).

2.3 0x1大豆幼苗外源基因的检测及酶切分析

　　为了确证0x1样品的检测结果，取0x1剩余样品中100粒大豆种子，种在花盆里.15 d后取其根和真叶，每1株作为1个样品材料，共提取80株幼苗的DNA，对这80份样品做了上述3项外源基因检测.

( i) CaMV35s启动子.

80份0x1幼苗样品都没有在此引物扩增中出现特异条带.

(ii) NOS终止子.大部分样品都在NOS终止子引物扩增中出现特异条带(图6)，随机挑选部分特异条带对其做回收，酶切鉴定结果证明特异条带为阳性(图7).

(iii)大豆草甘嶙抗性基因CP4-EPSPS.

　　 Oxl所有幼苗样品中有2个样品在CP4-EPSPS引物扩增中出现特异条带(图3)，对其PCR产物回收用BamH工做酶切分析，结果显示该条带不能被切开(图4).因此，初步认为这2个样品为假阳性.

2.4外源基因的巢式PCR检测
　　为了确证0x1是否有可能是RR大豆，以0x1幼苗样品的DNA为模板，针对RR大豆特有的转基因序列((CaMV35s启动子一叶绿素信号肤编码基因CTP4一抗除草剂基因EPSPS)设计2对引物利用巢式PCWIo]进行扩增.在第1轮PCR反应中，0x1幼苗样品中没有扩增出目标片段.第2轮反应以第1轮PCR反应的产物为模板，所以扩增的片段相对较小，为147 by.除阳性对照外，0x1幼苗样品均没有得到扩增条带(图8).结果表明，可疑样品0x1不含有CTP4成分(RR转基因大豆的外源基因).

2.5 0x1样品扩增片段的测序
　　对0x1样品在CP4-EPSPS引物扩增中得到的片段进行回收、克隆和测序.该序列在NCBI数据库中Blast结果表明，它与CP4-EPSPS基因有81%的同源性，而与中华根瘤菌的一段基因组序列同源性高达86%(图9).此结果再次证明，用CP4-EPSPS引物在我们采集样品中所扩增出的片段不是转基因大豆的CP4-EPSPS基因片段.

3讨论和结论

　　在转基因成分检测时，有效种子样品的采集制备及防止大量PCR样品制备中的交叉污染对结果的准确性有决定性作用.对于大量样品的PCR检测，研究准确的采样部位与简洁、快速的DNA提取方法，是获得正确结果的基础.农业部颁布的《转基因植物及其产品检测—大豆定性PCR方法》中规定，在大豆样品DNA提取时，少量大豆籽粒采用液氮研磨方法.本研究对大豆不同部位取材及不同研磨方法进行了比较，使用的方法包括:液氮研磨干种子、沙中培养幼苗、取真叶进行研磨、种子发芽、取胚根研磨、种子直接半浸泡、取胚根研磨和大豆种子置入小型粉碎机中粉碎.结果表明，液氮直接研磨干种子费时费力，且在研磨过程中样品损失较大;种子沙培后便于取材，但培养周期较长;种子纸间发芽和半浸泡法时间短，但难于避免种子霉烂而不利于取材;将种子置于粉碎机中粉碎不但省时省力，且由于粉碎杯便于彻底清洁，避免了样品的交叉污染.因此，对于20 g以上大豆样品的检测，建议用小型粉碎机粉碎取样较为适宜.0x1样品在CP4-EPSPS基因检测时扩增出特异条带，但该片段略大于阳性转基因大豆的扩增片段，且不能被BamH工酶切(图3).再进一步对0x1样品中CP4-EPSPS引物扩增出的片段进行测序发现，该序列与CP4-EPSPS基因序列存在较大差异，同源性仅有81%，且扩增序列中没有BamH工的酶切位点，这可能就是BamH工不能成功酶切的原因.对0x1样品CP4-EPSPS引物扩增片段的序列分析还发现了一个有趣的现象.该序列与GenBank中的中华根瘤菌的基因组序列(Sinorhizobium meliloti1021全染色体;segment 2/12)的同源性为86%，高于与CP4-EPSPS基因序列的同源性.因此，我们推测该序列有可能为某种根瘤菌的序列，而这种根瘤菌的序列尚未在基因库中注册.根据根瘤菌和大豆的共生关系，根瘤菌侵染大豆的根部是很普遍的，但我们尚未看到有关根瘤菌侵染大豆种子的报道.对于0x1样品在NOS终止子检测中出现特异性条带，扩增条带酶切正确，我们目前还没有很好的解释.因为其出现的频率很低(1/210)，是否是污染造成的假阳性?
　　综合分析试验结果表明，在黑龙江省大豆生产田中没有检测到CP4-EPSPS转基因成分.说明我国进口的转基因大豆，尚未影响到我国大豆主产区一黑龙江的大豆生产.为了进一步对转基因大豆在我国的扩散和影响进行监测，今后应该对我国的大豆主要进口港或加工基地周围一定范围内的大豆生产田进行检测监控，同时也应对野生大豆加以关注，以保证大豆的进口、加工和运输严格按照国家“转基因生物安全管理条例”的要求进行，不会对我国的大豆生产造成不良影响.