脂类化合物是植物种子中贮藏能量最常见的方式之一，储存脂类的亚细胞器颗粒被称为油体(oil body)或类脂体(lipid body)。油体通常在植物储藏器官如子叶、胚乳或盾片中积累，但关于油体在成熟种子中的形成机制现在仍然存在着争议。油体的结构非常简单，一般认为，油体内部为液态基质，主要成份是三酰甘油酯(TAG)，外面被一层主要由磷脂分子形成的半单位膜所覆盖，而油体蛋白(oleosin)以膜嵌入的方式依附在油体表面[1]。油体蛋白的分子结构比较特殊，其 N 端和 C 端为亲水区域，通常暴露在油体的表面，而油体蛋白的中部区域极端疏水，常常形成一个柄状结构深深插入到油体内部。油体蛋白的这种结构特性使其成为表达和纯化其他外源蛋白的一个理想载体，并正在引起人们的关注[2]。已经从多种植物种子中分离到油体及其相关的蛋白[3~6]。大豆中含有4 种油体蛋白，分子质量分别为34、24、18 和 17 kDa[7]，其中 24 kDa 油体蛋白是最丰富的一种。1991 年，Kalinski 等人在构建大豆、玉米和油菜油体蛋白的 cDNA基因文库时发现，所获得的克隆均在基因 5 末端编码区的下游相似位置被截断[8]，这似乎表明全长的油体蛋白基因对大肠杆菌可能存在着某种毒害作用。为进一步验证油体蛋白或其某个结构域对大肠杆菌细胞的这种毒害作用，笔者自大豆中克隆出 24kDa 油体蛋白基因[9]，并构建了含该蛋白基因全长编码序列及基因不同缺失部分的细菌性表达载体，进而在大肠杆菌中进行诱导表达研究与分析，本文报道相关的研究结果。

１　　材料与方法　
１．１　　植物材料　

　　供试大豆（Glycine maxL. Merr. cv. Century）由中国农业科学院作物品种资源研究所邱丽娟研究员提供。

１．２　　载体与宿主菌　

　　pTO 质粒为完整的大豆 24 kDa 油体蛋白基因插入到 pGEM-T质粒载体中，由本实验室构建[9]；pELC质粒为 LTB 和 CS6B 融合基因插入 pET-28(a)质粒中，由本实验室构建；细菌表达载体 pET-28(a)购自Novagen 公司；E.coli DH5á 菌株由本实验室保存；E.coli BL21(DE3)菌株购自 Novagen 公司；E.coliRosetta(DE3)菌株为专门设计用于增强含有稀有密码
子的真核蛋白在 E.coli 中表达的一个宿主菌，购自Novagen 公司。

１．３　　试剂　

　　IPTG购自Sigma公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶以及各种限制性内切酶购自大连宝生物(TaKaRa)公司；? 噬菌体 DNA(EcoR I &Hind III 酶切)核酸标准分子量购自华美生物工程公司；蛋白标准分子量购自 Pharmacia；其他常用化学试剂购自北京化学试剂商店，均为分子生物学级或分析纯。

１．４　　大豆油体蛋白的提取

　
　　参照Parmenter等[10]的“漂浮-离心”法：取0.5 g 干种子于 8 ml 提取缓冲液(0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1 MgCl2、0.15 mol·L-1 Tris-Cl，pH 7.5)中，匀浆后用几层纱布过滤，12 000 r/min离心 20min。在提取缓冲液中重悬油体层，再离心，将二次离心的油体层在 5 ml 漂浮缓冲液(0.4 mol·L-1 蔗糖、10mmol·L-1 KCl、1.0 mmol·L-1 MgCl2、0.15 mol·L-1Tris-Cl，pH 7.5 )中重悬，12000 r/min 离心 20 min。再收集油体层，重悬于 0.1 mol·L-1 NaHCO3，0 冰浴 30min，12 000 r/min 离心 20 min，收集油体层。用过量丙酮在 0℃抽提 3 次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于适量无菌水中。

１．５　　抗血清的制备

　
　　将提取的大豆油体蛋白样品与等体积 2×SDS 上样缓冲液混合，煮沸变性 5 min，然后离心取上清液进行 SDS-PAGE 电泳[11]，凝胶浓度为12%。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色和脱色，从 SDS-PAGE 凝胶上切取含有 24 kDa 目的蛋白的条带，利用蛋白质电泳回收槽(北京六一仪器厂产品)回收目的蛋白。将纯化的蛋白与福氏不完全佐剂等量混合后，充分乳化，然后通过腹腔注射免疫实验小鼠(BALB/c)，每隔 7d 注射 1次，每次注射 1 ml(含抗原蛋白1 mg)。在第 6 次注射后第 10 d 从小鼠眼部取血，37 放置 1 h，离心后收集抗血清并保存于 4 冰箱中备用。

１．６　　引物设计与合成

　
　　根据已知的大豆24 kD油体蛋白编码区核苷酸序列[9]，合成如下引物：引物1 核苷酸序列为5 -TAGAGCTCATGACCACACAAGTACCACC-3 ，与大豆 24 kDa油体蛋白基因 N 端编码区核苷酸序列完全同源，并在5 末端引入 Sac I 酶切位点(见引物中下划线部分)；引物 2 序列为 5 -GAGAGCTCAGGAACCCTCACCGGACTGGCAG-3 ，与 24 kDa 蛋白基因编码区第 223～245位核苷酸序列同源，在该引物 5 末端也引入了 Sac I位点；引物 3 核苷酸序列为5 -GTACTCGAGGGTTGTTGCTGTCACTGTTGTTC-3 ，与 24 kDa 蛋白基因 C端编码区核苷酸序列互补，在该引物5 末端引入 Xho I酶切位点；引物 4 序列为 5 -GTACTCGAGGCCAGGGTCAATCCCGCCAGGAG-3 )，与 24 kDa 蛋白基因编码区第 190～222 位核苷酸序列互补，在该引物 5 末端引入 Xho I位点。引物 5 序列为 5 -GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGACCACACAAGTACCACCAC-3 ，与 24 kDa 蛋白基因 N 端编码区核苷酸序列同源，在该引物 5 末端引入 Kpn I 酶切位点和肠肽酶识别位点(见引物中框架部分)；引物 6 序列为 5 -GCCTCTAGAATCATCATCATCCTTGGTTGTTGCTGTCACTGTTGTTC-3 ，与 24 kDa 蛋白基因编码区 C 端核苷酸序列互补，在 5 末端引入 Xba I位点和肠肽酶识别位点。引物均由北京三博远志生物技术责任有限公司合成。

１．７　　细菌表达载体的构建　

　　以 pTO 质粒 DNA 为模板，分别利用引物 1 和引物 3 扩增获得完整的24 kDa oleosin基因序列、该基因 DNA片段经 Sac I和 Xho I双酶切后，被定向插入到 pET-28(a)质粒的相应酶切位点内得到细菌表达载体 pEOC(图 1A)；以引物 2 和引物 3 扩增出缺失 N 端222 个核苷酸编码序列(编码 N 端 74 个氨基酸残基)的24 kDa oleosin 基因序列、引物 1 和引物 4 扩增出缺失C 端 22３～678 个核苷酸编码序列(编码 C 端 152 个氨基酸残基)的 24 kDa oleosin基因片段，这 2 个片段经Sac I 和 Xho I 双酶切后，分别被插入到经同样酶切的pET-28(a)质粒中，构建大肠杆菌表达载体 pEOC、pEOT(图 1B、C)；引物 5 和引物 6 扩增得到的与大肠杆菌热敏毒素 B 亚基(LTB)和定居因子 CS6 B(CS6B)亚基基因以串联方式融合的完整油体蛋白基因片段经Kpn I和Xba I双酶切后插入质粒pELC 的Kpn I和XbaI 位点，构建细菌表达载体 pELOC (图 1D)。PCR 扩增循环参数为：94 3 min；94 30 s，55 30 s，72 1min，30 个循环；72 7 min。

１．８　　油体蛋白基因在大肠杆菌中的蛋白表达产物分析　

　　利用上述构建的细菌表达载体分别转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3)和 Rosetta(DE3)，挑选含载体的单细胞克隆，分别接种 5 ml LB 液体培养基（含 kan 50mg·L-1或 kan 50 mg·L-1，chl 34 mg·L-1），过夜培养。按 1%接种量接种 10 ml 含相同抗生素的 LB 液体培养基，37 振荡培养，待培养物生长至 OD600为 0.4～0.5时，加入终浓度为 1 mmol·L-1的 IPTG，继续在37 培养 12 h 以诱导外源蛋白表达。首先取出部分菌液分别测定诱导和未诱导的对照培养物的菌液浓度，并利用小量碱裂解法分别提取质粒[12]。其余菌液离心后将菌体悬浮于 1×SDS上样缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 6.8，100 mmol·L-1 DTT、2% SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油)，在沸水中煮 5 min 破碎菌体，离心后取上清液进行15%的SDS-PAGE电泳检测，并进行Western印迹分析[13]。

２　　结果与分析　
２．１　　大肠杆菌表达载体的筛选与鉴定　

　　pEOC、pEOT、pEON 及 pELOC 分别转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3)感受态细胞后[14]，从固体培养平皿上挑选部分单细胞克隆，进行 PCR 和酶切鉴定筛选。四种表达载体通过 PCR 扩增均可获得相应的基因片段，而且通过双酶切分析，同样可验证载体质粒中确实含有各目的基因片段(图 2)。

２．２　　各表达载体对大肠杆菌细胞生长状况的影响　

　　含有细菌表达载体 pEOC、pEOT、pEON 或pELOC 的大肠杆菌菌株 BL21(DE3)，在加入 IPTG 诱导物后，一些宿主菌的生长状况发生了变化，细胞繁殖速度受到明显抑制。测定诱导 12 h 后的细菌菌液浓度时发现，含 pEOC、pEON 或 pELOC 质粒载体的菌液浓度比未加入 IPTG 诱导物的对照菌菌液浓度大约低 3 倍，只有 pEOT 其诱导表达产物对宿主细胞的生长繁殖未产生任何不利影响(图3)。值得提出的是，尽管细菌宿主细胞的生长受到了抑制，但在提取这些宿主菌的质粒时发现 pEOC、pEON 和 pELOC 质粒仍然存在，并未丢失。在对菌液浓度进行相应调整后，经碱法小规模提取质粒后发现质粒 DNA 的相对拷贝数并没有任何变化。

２．３　　各表达载体诱导产物的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析

　
　　Mort 等认为真核蛋白的疏水区域通常对大肠杆菌细胞是有害的[15,16]，最直观的表现是细菌细胞的生长受到了抑制。此外，Kalinski 等在构建大豆、玉米和油菜油体蛋白的cDNA基因文库时发现克隆获得的所有目的基因 5 端编码区核苷酸序列全部缺失[8]。大豆 24 kDa 油体蛋白中因为存在着类似的疏水区域，因此尝试在细菌细胞中表达该蛋白完整多肽可能会遇到极大困难。是大豆24 kDa 油体蛋白(图 4)从中前部第53 位氨基酸开始到第 131 位之间是一个大的疏水区域，这个疏水区不仅参与油体蛋白在油体表面的定位，同时还可能还参与翻译过程中油体蛋白在植物内质网上的定位[17]。鉴于上述情况，在构建细菌表达载体pEOT 时，N 端编码区的 222 个核苷酸碱基被切除，中包括了疏水区的前66个核苷酸碱基(编码22 个疏水氨基酸残基)。与此相反是，在构建pEON 表达载体时，被保留的恰恰是 pEOT 中缺失的核苷酸编码区。SDS-PAGE 分析结果表明，含有完整大豆 24 kDa 油体蛋白基因或其N端部分氨基酸编码序列的细菌细胞内是没有外源重组蛋白积累的，相反，只有 pEOT 细菌细胞内观察到有新的蛋白带产生，而且 Western 印迹分析发现也只有该蛋白带能够与油体蛋白抗血清发生特异性血清学反应(图 5A、B)。