刘　莹1,盖钧镒1,①,吕慧能1,王永军1,2,陈受宜2,①

(1.南京农业大学大豆研究所,国家大豆改良中心,作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京　210095;

2.中国科学院遗传与发育生物学研究所植物生物技术开放实验室,北京　100101)

摘　要:从301份黄淮海和长江中下游地区代表性大豆地方品种和育成品种(系)中按根系类型选取59份,在苗期干旱胁迫和非胁迫条件下对地上部和地下部性状进行2年重复鉴定,发现材料间性状隶属函数值具有丰富遗传变异,以株高、叶龄、根干重和茎叶干重隶属函数的算术平均数为抗旱综合指标从中筛选出汉中八月黄、晋豆14,科丰1号,圆黑豆等强耐旱型(1级)和临河大粉青、宁海晚黄豆等干旱敏感型(5级)材料。比根干重、比总根长、比根体积与耐旱隶属函数平均值均呈极显著正相关,可作为耐旱性的根系性状指标。利用“科丰1号×南农1138 2”(1级×4级)衍生的RIL群体为材料,对耐旱相关根系性状采用主基因+多基因混合遗传模型分离分析法进行遗传分析并进行QTL定位。结果表明,该两亲本间比根干重、比总根长、比根体积的遗传均为两对主基因加多基因模型,后两者主基因间有连锁(重组率分别为4 30%和1 93%);主基因遗传率为62 26%～91 81%,多基因遗传率为2 99%～24 75%;耐旱相关根系性状各主要由1对主基因控制,另1对效应较小。QTL分析检测到5、3、5个QTLs分别控制比根重、比根总长、比根体积,位于N6 C2、N8 D1b+W、N11 E、N18 K连锁群上。3性状各有1个贡献率大的QTL(Dw1,Rl1,Rv1),而且均位在N6 C2的STAS8_3T STAS8_6T相同距离的区段上,其他QTLs效应均较小。分离分析与QTL定位的结果相对一致。

关键词:大豆;耐旱性;根系性状;相关;遗传;数量性状分离分析;QTL定位

　　我国是一个严重缺水的国家,北方大豆产区受旱面积不断增加,虽然我国南方虽然全年雨量充足,但分配不均,也常出现季节性干旱,因而选育大豆耐旱品种已成当务之急。前人从形态、生理、分子等多个角度对大豆耐旱性进行了研究[1～6],鉴定并筛选出了一些耐旱性较强的种质,开展了耐旱性育种。作物对土壤干旱首先感受的器官是根系,根系作为研究和改良作物耐旱性的一个重要组成部分,正引起研究者的重视[7～10]。Hudak[5,8]等曾比较了2个农艺性状相近但抗旱性不同的大豆品种的根系性状,发现抗旱性强的品种的根量、根体积、根表面积远远超过抗旱性差的品种。对大豆耐旱相关根系性状的研究国内还未见报道。本文在耐旱性种质资源鉴定筛选的基础上,探索与耐旱性相关的根系性状,利用耐旱性有差异的材料杂交衍生的RIL群体对耐旱相关的根系性状进行遗传分析和QTL定位,为大豆耐旱根系育种提供材料和依据。

1　材料和方法

1.1　品种耐旱性鉴定实验

1.1.1　供试材料的选择

　　从黄淮海和长江中下游大豆生态区选取301份地方品种和育成品种,田间播种后于根系形态稳定的结荚鼓粒期挖根观察根系形态,根据所属根系形态类型从中选取代表性的材料59份(表1),用于进一步的耐旱性鉴定和根系观察实验。

1.1.2　盆钵实验设计与实施

　　分别在2001年6月、2002年7月于国家大豆改良中心江浦实验基地温室内进行。盆播:盆钵规格为25cm×28cm,采用砂-土(85∶15)混合基质(7kg基质/盆)。裂区设计:主区为水分处理(适宜水分与干旱胁迫),副区为材料,每副区为一盆,种子催芽后挑选胚根长度一致的种子播种,每盆留2株,3次重复。待植株对称叶展开时进行水分处理,水分胁迫加水30mL/盆·d,水分适宜加水100mL/盆·d,共处理18d。水分处理前后测定株高、叶龄各一次,处理18d后收获。以子叶节为界把植株分为地上部分(简称茎)和地下部分(简称根),立即将根浸入FAA固定液,将茎放进烘箱(105℃)杀青30min,然后80℃下烘至恒重,冷却后称重。将根浸泡30min后取出,观察根系形态,测定根系性状,以后处理同茎。

1.1.3　根系形态指标的观察

　　总根长和根体积:将固定后的根取出,剪下基根(basalroot)及主根(taproot),置Epson扫描仪上扫描,采用WinRhizo根系分析软件计算总根长、根体积。比根重、比总根长、比根体积为干旱条件下的根干重、总根长、根体积与整株干物重之比。

1.1.4　统计分析

　　将2年耐旱鉴定数据转算成隶属函数值后进行联合方差分析。品种耐旱隶属函数值的计算,可先计算各重复的隶属函数值,再求品种平均耐旱隶属函数值;本文则按先计算得到平均株高、叶龄、茎干重、根干重,并计算各指标胁迫平均值与适宜平均值的比值,其中株高、叶龄分别以每10d平均生长率参与计算。按下式计算耐旱隶属函数值:Fij=（Xij-Xmin）／（Xmax-Xmin）;　Fi=1／n∑Fij　　Fij为第i个材料第j个性状的隶属值,Xij为第i个材料第j个性状胁迫对非胁迫的比值,Xmax、Xmin分别为该性状中最大、最小比值。最后按材料将各性状的隶属值进行平均,得平均隶属函数值Fi。各供试材料按照下列标准进行耐旱性分级:1级:平均隶属值在0.8以上———强耐旱型;2级:平均隶属值在0.6～0.8之间———较强耐旱型;3级:平均隶属值在0.4～0.6之间———中间型;4级:平均隶属值在0.2～0.4之间———干旱较敏感型;5级:平均隶属值在0.2以下———干旱敏感型。对隶属函数值和根系性状进行了相关分析。以上统计分析均在SAS8.2version下完成。

1.2　耐旱相关根系性状遗传的分离

　　分析供试材料为科丰1号(1级)和南农1138 2(4级)杂交得到并经过调整[11]的184个RIL家系。将各家系连同2亲本盆播,盆钵规格和水分胁迫处理同1 1,随机排列,3次重复。种子催芽后挑选胚根长度一致的种子播种,出苗后每盆留1株,V4期收获。处理结束后扫描根系,计算总根长、根体积并测定根干重,应用盖钧镒等[12]的数量性状主基因+多基因混合遗传模型进行遗传分析。

1.3　耐旱相关根系性状的QTL分析

　　利用上述群体构建的分子标记连锁图谱[11],用QTLCartographerV2.0分析软件进行复合区间作图和QTL分析[13],LOD值大于3 0作为QTL存在的阈值。

2　结　果

2.1　大豆种质间耐旱性及耐旱相关根系性状的遗传变异　　

　　2年4个生长性状的隶属函数值联合方差分析(表2)结果显示:株高、叶龄、茎叶干重、根干重隶属函数值在品种间和年份间F值均甚大,呈极显著差异;各性状误差均甚小,误差变异系数为3 63%～5 82%,实验精确性甚好。茎叶干重的年份与品种间互作不显著,其他3性状F统计值虽很显著但均相对较小,这与实验误差小有关。供试材料耐旱性和根系性状的2年平均表现与遗传变异统计结果见表3。供试材料株高、叶龄、根干重、茎叶干重隶属函数值的遗传变异系数GCV为19 7%～22 5%,均具有较大的遗传变异和丰富的选择潜力;比根干重、比根总长、比根体积的GCV为8 0%、13 4%和12 8%,具有一定的遗传变异和选择潜力。

　　表3中供试材料间株高、叶龄、根干重、茎叶干重的隶属函数值平均数(0 537,0 560,0 477,0 464)较为接近,遗传变异系数(25 5%,23 1%,20 6%,19 7%)也相差不大,因而未考虑加权,迳用每个材料各性状隶属函数的算术平均数作为品种耐旱性的综合指标。曾比较过采用3个、4个、5个(加上其他根系性状)性状的平均数,结果相对一致。鉴于株高、叶龄、根干重、茎叶干重比较容易测量,可一次完成,性状太少又易波动,故用此4者的平均数作为品种耐旱性的综合指标。两年间平均隶属函数值相关系数r=0 83 ,表明实验结果在年度间具有相对的一致性。按耐旱性综合指标,即株高、叶龄、根干重、茎叶干重隶属函数值平均数进行品种耐旱性鉴定和分级的结果列于表1。供试材料中,2年表现一致的耐旱(1级)材料为汉中八月黄、晋豆14,园黑豆,科丰1号,2年平均1级的还有易县黑豆;干旱敏感型(5级)的材料为临河大粉青、宁海晚黄豆,2年平均5级的还有南农1138 2×86 53。耐旱材料主要来自北方干旱地区。重组自交系亲本科丰1号和南农1138 2耐旱性分属于1级和4级。表1为由每年各重复间平均值计算的各性状隶属函数值的平均数,此结果与各重复分别计算隶属函数后的平均数结果相对一致。据陈佳敏等采用同一组材料、同一方法所获试验结果与本文结果也相对一致(另文报告)。干旱胁迫下根系性状与耐旱平均隶属函数相关分析结果表明(表4),根干重、总根长、根体积与耐旱性无相关,而比根重、比总根长、比根体积与平均耐旱隶属函数值的相关均呈极显著正相关,该3个根系相对性状可能作为鉴定大豆苗期耐旱的间接指标。

2.2　大豆耐旱相关根系性状的遗传分析

　　对两个亲本和RIL群体根系性状的平均值作方差分析(表5),结果表明干旱胁迫下所测定的3个根性状指标(比根干重、比总根长和比根体积)在双亲及RIL群体内各家系间均达0 01水平显著差异,误差变异系数甚小(4 9%～5 6%),实验精确性甚好。该群体耐旱相关根系性状遗传变异系数在32%以上,遗传率在77%或以上。

　　表6为对该RIL群体耐旱根系性状进行的遗传分析结果,经最大概率熵AIC值和适合性检验[12],该两亲本间(1级与4级间)比根干重、比总根长和比根体积的遗传均为2对主基因加多基因模型,主基因遗传率分别为91 81%、75 35%、62 26%,多基因遗传率分别为2 99%、11 15%、24 75%;耐旱相关根系性状主要由主基因控制,后两者2对主基因间还存在连锁,重组率分别为4 30%和1 93%(表6、表7)。比根体积的2对主基因中有1对加性效应较强,另1对较弱;比根干重和比总根长的2对主基因加性效应差异较小,前者还存在小量加性×加性效应。这3性状的改良均应着重在主基因加性效应。

2.3　大豆耐旱相关根系性状的QTL定位

　　通过复合区间作图法对耐旱相关根系性状进行QTL定位(表8),结果表明,控制3个耐旱相关根系性状的QTL定位在20个连锁群中的4个连锁群上(图1)。

　　比根重检测到5个QTL位点,分别位于王永军等[11]连锁图的N6 C2、N8 D1b+W、N11E连锁群上,其中贡献率最大的Dw1为24 7%,在N6 C2上,其他4个分别在N8 D1b+W和N11E上,效应不大。比根总长检测到3个QTL位点,分别位于N6 C2、N8 D1b+W连锁群上,其中贡献率最大的Rl1为22 9%,在N6 C2上,另2个分别在N6 C2和N8 D1b+W上,效应均不大。比根体积检测到5个QTL位点,位于N6 C2、N11E、N18 K连锁群上。其中贡献率最大的Rv1为22 0%,在N6 C2上,其他4个分别在N6 C2、N11E6、N18 K上,效应均不大。3个性状共涉及4个连锁群,各性状最主要的位点Dw1、Rl1、Rv1都在N6 C2上,其他次要位点分散在4个连锁群上,说明这3个根系性状都有1个最主要的位点,而且都在N6 C2上。该连锁群既与根系有关而且与耐旱性有关。各位点所在的标记区域、相应的遗传距离见表7。Dw1、Rl1、Rv13个位点都在同一STAS8_3T STAS8_6T区域,而且离两侧标记距离相同(1 7cM,0 7cM)。很可能该3个位点就在一起,或就是一因多效。

3　讨　论

3.1　大豆品种耐旱性鉴定指标

　　以往研究表明,采用生长性状做指标鉴定抗旱性以“平均隶属函数值”方法较可行[1,14]。本研究在苗期采用株高、叶龄、茎干重、根干重4个生长性状较易测量,其隶属函数值的群体平均数和变异系数都相近,故采取其算术平均数为抗旱综合指标。两年重复鉴定结果趋势相同(r=0 83),表明该指标适用,品种耐旱分级结果较为稳定可信。

3.2　大豆耐旱相关的根系性状

　　大豆品种之间存在相当大的生态、发育差异,直接比较品种间的根系性状未发现与耐旱性有关的指标,而采用相对值法便找到了比根重、比总根长、比根体积等3个相关的根系性状。Hudak和Patter son[8]比较两个农艺性状相近的耐、感干旱品种,发现其根量、根体积、根表面积等直接根系性状在抗、感之间有明显差异。该文所用直接根系性状虽与本实验相近,但与本实验耐旱根系性状为相对值的结果有所不同。从本文的结果看,相对值法在根系研究中,可能有特殊意义。

3.3　大豆耐旱相关根系性状的遗传分析和QTL定位

　　本文采用盖钧镒等[12]的数量性状主基因+多基因混合遗传模型分离分析方法对与耐旱相关的根系性状进行遗传分析,结果表明科丰1号与南农1138 2两亲本间3个耐旱相关根系性状均有2对主基因的差异。但南农1138 2的耐旱性仅为较敏感(4级),进一步的实验应采用更多、差别更大的材料为亲本,更全面地探究耐旱相关根系性状的遗传体系。比较遗传分析和QTL分析的结果,两者相对一致。分离分析法受最多可检测3对主基因的模型限制,能测出的基因数较少,QTL作图则不受此限制。但在本研究中两者都检测到各性状最主要的一对主基因,都发现其他位点效应较小。两者在检测到的一对主基因加性效应、次要基因加性效应方面,比根干重和比根体积的均甚相近;但比总根长的则第一对主基因加性效应相差较大。比根总长和比根体积在分离分析中均检测到两对主基因间有连锁,联系QTL分析结果,很可能就是QTL分析中的Rl1与Rl2和Rv1与Rv3。所以,综合比较两种方法进行遗传分析的结果相似,可相互验证,分离分析方法由于费用较低,在目前特别是当遗传图谱未饱和时具有广泛的应用价值。本研究中控制耐旱相关根系性状的主要基因Dw1、Rl1、Rv1定位在第N6 C2连锁群上,可见该连锁群在根系和耐逆性上的重要性。3个位点还都在同一STAS8_3T STAS8_6T区域同一离两侧标记1.7～0.7cM距离上,是否是同一基因有待进一步研究。本研究中部分基因定位在N8 D1b+W连锁群上,与大豆5个抗花叶病毒基因位于同一条连锁群[15]且遗传距离较近,启示在对大豆耐生物和非生物逆境的种质资源筛选时有可能筛选到同时具备抗病和耐旱特性的优异种质资源。大豆起源于我国,品种资源极为丰富,充分利用现有资源,从整体水平提高大豆的抗旱性对我国大豆生产的发展有着重大的意义。

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